Técnicas espectrales en análisis clínico
El profesional enfocado en el análisis clínico debe estar dotado de conocimientos fundamentales sobre técnicas espectrales.
facultad de medicina · análisis clínicos
jue. 30 de sep. 2021
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El profesional enfocado en el análisis clínico debe estar dotado de conocimientos fundamentales sobre técnicas espectrales. Estos indican, al tiempo, los protocolos e instrumentos que se utilizan en las dichos métodos comúnmente utilizados en los laboratorios.

Conceptos

Las técnicas espectrales son ampliamente utilizadas en el laboratorio de análisis clínico, dentro de la gran diversidad de técnicas que existen. Estas técnicas utilizan la luz como el fundamento de la medida, aunque también se ha incluido la espectrometría de masas. Para entender el funcionamiento de las técnicas espectrales, hay que entender qué es la luz.

La luz como energía estaría conformada por fotones. La energía asociada con cada fotón está relacionada con la frecuencia de forma directa y con la longitud de onda de forma indirecta, tal y como expresa la constante de Planck. La luz del laboratorio de análisis que se utiliza tiene una longitud de onda que oscila entre los 180 y los800 nm, desde el ultravioleta hasta la infrarroja.

La espectroscopia y la espectrometría son dos conceptos claves:

  • La espectroscopia es el conjunto de métodos que se basan en la interacción de la radiación electromagnética con la materia, que se traduce en absorción y emisión de energía.
  • La espectrometría es el conjunto de técnicas espectroscópicas que pueden medir esa interacción. Por ende, permiten cuantificar sustancias en muestras biológicas mediante la radiación que se absorbe o se emite.

Radiación electromagnética y su interacción con la materia

Una de las características esenciales de las radiaciones ionizantes (fotones, neutrones, partículas cargadas, etc) es su capacidad de penetrar en la materia e interaccionar con ella. En estas interacciones, la radiación pierde parte o toda su energía cediéndola al medio que atraviesa mediante distintos mecanismos de interacción. Dependen esencialmente del tipo de radiación, de su energía y de las propiedades del medio material con el que interactúan.

Estos procesos de interacción de la radiación con la materia son la causa de los efectos producidos por las radiaciones (en particular, los efectos biológicos producidos en seres vivos) y determinan las condiciones de propagación de la radiación en un medio material.

Absorción y emisión de la radiación

Cuando la luz incide con una determinada intensidad sobre una solución, la intensidad del haz que sale será menor, ya que parte es absorbida por la misma. Para poder utilizar este fenómeno en las técnicas espectrales, se usa la Ley de Lambert Beer.

En esta ley hay que conocer qué es la transmitancia de una solución. Para una longitud de onda concreta, es la fracción de radiación transmitida por la muestra. También es importante la absorbancia, que es el logaritmo inverso de la transmitanciaCuando aumenta la concentración de un compuesto en una solución, esta absorbe más luz. Por lo tanto, existe una relación directa entre absorbancia y concentración. Además con la longitud del cuerpo que la luz atraviesa según la fórmula de la ley de Lambert Beer. La ε de la fórmula corresponde al coeficiente de extinción molar, de absorción o de absortividad y depende de la medida de la cubeta de medición y de la muestra a analizar.

Pueden darse varios fenómenos cuando la luz incide en una molécula. Esto es fundamental para entender el valor de estas técnicas en análisis clínico. Conociendo estos conceptos de absorción y emisión, las técnicas espectrales pueden ser diferenciadas en:

  • Técnicas de espectrofotometría: una parte de la luz es absorbida por las moléculas y una parte se transmite sin perder energía.
  • Nefelometría y turbidimetría: la luz se dispersa por la partícula y cambia de dirección, pero con la misma energía.
  • Espectrometría de masas: no está influenciada por la luz, pero se basa en la creación de espectros para la cuantificación.

Espectrofotometría

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en una solución. Es la técnica más usada dentro de las espectrales para el análisis clínico. El análisis que se obtiene puede ser tanto cualitativo como cuantitativo.

  • Cualitativo: se compara el espectro de absorción de la muestra con patrones conocidos y se identifican las bandas de absorción coincidente. Suele utilizarse una longitud de onda en el infrarrojo (por ejemplo, para el análisis de cálculos urinarios).
  • Cuantitativo: se calcula la concentración de una muestra basándose en la Ley de Beer. Conociendo el coeficiente de extinción molar de la sustancia, se puede calcular según la fórmula: c (mol/L) = A/ (ε xb), siendo b la anchura de la cubeta en centímetros (cm). También si se conoce la absorbancia de la sustancia en una solución se puede calcular en base a otra solución de calibración.

Las aplicaciones en el laboratorio de análisis clínico son muy amplias y de uso frecuente. Por ejemplo, la determinación de la concentración de proteínas, de ácidos nucleicos y la determinación de enzimas (ELISA) que es la más frecuente y utilizada, y las colorimetrías para medir la absorbancia de un grupo coloreado o cromóforo. Las técnicas de espectrofotometría se pueden diferenciar en espectroscopia de luz visible-ultravioleta y la de infrarrojo.

Instrumentación

La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos aparatos llamados espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros constan de:

  • Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterioy tungsteno.
  • Un monocromador: para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas y redes de difracción.
  • Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que contenga la muestra: pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV.
  • Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales eléctricas.
  • Un registrador o sistema de lectura de datos.

Procedimiento

Para llevar a cabo la medición, primero se tendrán que obtener las denominadas curvas de calibrado.

Para obtener la curva de calibrado de un compuesto se preparan soluciones de diferentes concentraciones del mismo, determinándose para cada una de ellas el valorde absorbancia a λmax. Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas (eje de x) y los de concentración en el eje de ordenadas (eje de y). La representación de Lambert-Beer, A = ε·c·l, permitirá calcular el valor del coeficiente de extinción molar, que corresponde a la a pendiente de la recta.

Ahora se tiene que obtener el espectro de absorción de la sustancia problema. Este es una representación gráfica que indica cantidad de luz absorbida (ε) a diferentes valores de λ.

Absorción atómica

Es una técnica ampliamente usada en el laboratorio clínico, principalmente para la determinación de elementos químicos como zinc, litio, aluminio, hierro y otros metales pesados. Es una técnica como la descrita anteriormente, basada en la capacidad de los átomos de absorber o emitir energía. Una de las ventajas de esta técnica es su sensibilidad, además de ser muy precisa. Entre sus desventajas se encuentra que en ocasiones no cumple la Ley de Lambert Beer debido a un alto grado de interferencia.

La diferencia fundamental con la técnica espectrofotométrica anterior es que ahora se basa en las propiedades atómicas, no moleculares. Por lo tanto, se está considerando la medición de la absorción y emisión de energía de elementos químicos individuales.

El fundamento se basa en la capacidad que tienen los electrones de un elemento químico en el estado fundamental para saltar a orbitales más excitados gracias a la energía lumínica que absorben. Los electrones de cada sustancia realizan saltos característicos y a una longitud de onda concreta, por ello cada elemento forma un espectro concreto.

Fotometría de emisión en llama

Consiste en la excitación térmica de los átomos utilizando una llama o chispa en una longitud de onda determinada según la sustancia. De esta manera, cuando los electrones vuelven a su estado basal de energía, la liberan en una longitud de onda característica de cada elemento, que se puede cuantificar. La intensidad de la energía que emiten los átomos es directamente proporcional a la cantidad de átomos excitados y, por tanto, a la concentración del elemento a valorar en la muestra.

Esta técnica actualmente no se utiliza prácticamente en el laboratorio de análisis. Ha sido sustituida por métodos menos costosos y sencillos de utilizar, pero ha sido ampliamente utilizada para la determinación de elementos químicos abundantes, como sodio, potasio, litio, en líquidos biológicos.

Fluorimetría

Esta es una técnica de análisis químico cuantitativo que consiste en medir la intensidad de la radiación fluorescente emitida al excitar con radiaciones un compuesto del elemento que se quiere determinar. Existen dos tipos de fotoluminiscencia:

  • Fluorescencia: la emisión de radiación cesa cuando desaparece la energía de excitación.
  • Fosforescencia: la emisión se prolonga en el tiempo.

El fundamento de la técnica es similar a los explicados, solo que es la molécula la que absorbe fotones procedentes de la fuente de energía y pasa a un estado más excitado. Cuando vuelve a su estado inicial o estado fundamental, emite esa energía en forma de luz, que puede ser cuantificada. La intensidad de la luz será proporcional a la concentración del fluoróforo o molécula fluorescente y a la intensidad de la fuente emisora inicial.

La instrumentación en este caso es diferente, ya que se usan fluorímetros. La diferencia con los espectrofotómetros radica en la colocación de los monocromadores, que se sitúan antes y después de la cubeta de muestra para captar la fluorescencia emitida. El detector va a estar colocado en un ángulo de 90o respecto a la luz, para una mayor sensibilidad.

Nefelometría y turbidimetría

Basándose en los principios explicados sobre la dispersión de la luz debido a las partículas en suspensión de una solución, se tienen estas dos técnicas de análisis que presentan dos fundamentos diferenciados.

La nefelometría mide la luz desviada en diversos ángulos (entre 15o y 90o) por las partículas presentes en esta suspensión. Para la nefelometría es necesario emplear un equipo con características específicas, que recibe el nombre de nefelómetro y sus componentes básicos son:

  • Fuentedeluz: en la actualidad se usan lámparas de arco de mercurio (Hg), diodos emisores o láser de helio-neón, de baja potencia.
  • Sistema colimador (innecesario con la lámpara deláser), cuya función es la de concentrar el rayo de luz en haces paralelos.
  • Los componentes propios de un espectrofotómetro (selector de longitud de onda, cubeta de medición y detector).

Debido a su sensibilidad, las medidas nefelométricas ocupan una posición destacada en los laboratorios de análisis clínico. Se usan para ensayos cuantitativos que usan complejos antígeno-anticuerpo o para medir la cantidad de proteínas en fluidos (inmunoglobulinas, proteínas del complemento, proteínas de fase aguda o de coagulación, entre otras).

La turbidimetría mide la reducción de la intensidad de la luz en su paso a través de una suspensión, a causa de las partículas presentes en esta, y cuantifica la luz residual transmitida. La sensibilidad de la turbidimetría está limitada por la exactitud y sensibilidad del instrumento utilizado para la medición,. Depende de la capacidad del detector para registrar pequeños cambios en la intensidad de la luz. Las lecturas realizadas en longitudes de onda bajas, en un espectrofotómetro de buena calidad, permiten obtener buenos resultados, aunque solo para concentraciones relativamente elevadas.

Espectrometría de masas

Esta última técnica no está basada en los mismos principios que se han estado utilizando hasta ahora sobre la emisión y absorción de la luz. La espectrometría de masas se incluiría dentro de ellas, debido a que también se utilizarán espectros para cuantificar e identificar sustancias de una muestra en análisis clínicos.

Los espectros de masas se obtienen convirtiendo los componentes de una muestra en iones gaseosos. Se mueven rápidamente en presencia de un campo magnético y se separan en función su relación masa/carga. Un espectro de masas representa la abundancia relativa de los distintos iones en función de su relación masa/carga (m/z).

La espectrometría de masas es una herramienta analítica muy poderosa y de aplicación muy general. Los espectros de masas suministran información sobre la estructura de especies moleculares complejas, las relaciones isotópicas de los átomos en las muestras, y la composición cualitativa y cuantitativa de analitos orgánicos e inorgánicos en muestras complejas

Instrumentación

La instrumentación es extraordinariamente compleja. Los componentes principales de un espectrómetro de masas son:

  • Sistema de entrada: su objetivo es introducir una pequeña cantidad de muestra (un micromol o menos) en el espectrómetro de masas.
  • Fuente de ionización: convierte los componentes de la muestra en iones. Esto puede conseguirse por bombardeo con electrones, moléculas o fotones. Alternativamente, también puede lograrse la ionización mediante energía térmica o eléctrica.
  • Analizador de masas: la función del analizador de masas es la separación de los iones en función de su relación masa/carga (m/z).
  • Detector: el detector convierte el haz de iones en una señal eléctrica que puede ser procesada y almacenada.
  • Almacenamiento y procesado de datos: los espectros de masas se almacenan y procesan en un ordenador. Es muy frecuente la construcción de bibliotecas de espectros de masas que permiten la identificación casi inequívoca de cualquier compuesto por comparación.

Procedimiento

Para realizar una determinación de masas, se deben completar las siguientes etapas:

  1. Generación de las moléculas a identificar (y fragmentos moleculares y/o átomos) en fase gaseosa.
  2. Ionización de los mismos mediante la instrumentación adecuada.
  3. Separación en función de su relación m/z.
  4. Detección de los iones y almacenamiento, y procesado de los datos.

Es un procedimiento complejo que requiere del adecuado adiestramiento del personal que lo utilice. Normalmente contará con una persona que sea la que esté especializada en el uso de este instrumento complejo. Su uso más común será para la identificación y determinación estructural de compuestos puros y para el análisis de compuestos orgánicos en muestras complejas mediante una técnica combinada de acoplamiento cromatografía-espectrometría de masas.

Aplicación de técnicas

Dentro de las técnicas que se han ido detallando, las aplicaciones más usuales dentro del laboratorio de análisis clínico son las técnicas que se usan de manera rutinaria para la determinación de numerosos analitos en las analíticas más prescritas por los facultativos.

Se utilizan para detección y cuantificación de electrolitos como sodio, potasio, cloro, iones y moléculas derivadas del metabolismo como la glucosa, vitaminas, bilirrubina, ácido láctico, úrico, hormonas, etc. También son ampliamente usadas para la detección de marcadores patógenos, identificación bacteriana, análisis de complejos antígeno anticuerpo, proteínas complejas, ácidos nucleicos, etc.

Dentro de las novedades de uso de las técnicas espectrales está la incorporación de la espectrometría de masas a los laboratorios clínicos, tanto en el área de bioquímica como de microbiología. Esto ha sido en parte debido a dos avances importantes en la técnica que evitan la degradación o fragmentación de las proteínas de alto peso molecular. Además otro que facilita el proceso instrumental y el uso de rutina de este complejo método de análisis, dotándolo de un gran potencial para el análisis clínico.

Análisis clínico

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