High-throughput
Se llama High-throughput a las técnicas que permiten la obtención de resultados de manera repetitiva y a gran escala.
facultad de nutrición · genómica
vie. 16 de jul. 2021
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Se llama High-throughput (o alto rendimiento) a las técnicas que permiten la obtención de resultados de manera repetitiva y a gran escala. En el ámbito de la salud se utiliza para secuenciar millones de moléculas de ADN al mismo tiempo, con el fin de estudiar la composición de los alimentos en relación a la nutrición genómica.

NGS

Las siglas NGS vienen de secuenciadores de nueva generación (del inglés Next Generation Sequencing). Sin embargo, también se conoce como secuenciación masiva y secuenciación de segunda generación. Se han visto los aspectos técnicos y económicos que han popularizado la NGS, pero ¿cómo funciona?

Primer paso

El primer paso para la NGS es la preparación de librerías. En este paso se fragmenta el ADN en fragmentos de un tamaño concreto (entre 300 y 600 pb) y se amplifican todos los fragmentos. Este paso sería equivalente a la amplificación de la región de interés del método Sanger. Pero a diferencia de Sanger, aquí no es necesario conocer la región de antemano ya que se amplifica todo el genoma.

Durante la preparación de la librería, se unen unos adaptadores y unos índices a los fragmentos de ADN. De este modo, al final de la amplificación se tienen millones de fragmentos de ADN, cada uno con un cola conocida.

Barcode

Estas colas sirven ahora de molde para otros cebadores complementarios a los adaptadores que contienen también una secuencia conocida igual para todas las muestras. Una parte de 6-8 nucleótidos de secuencia que será específica de cada muestra. A esta parte concreta se la llama índice o barcode. Sirve de “etiqueta” para cada muestra. Al final de la preparación de la librería, tienen millones de fragmentos de ADN en cadena sencilla. Cada fragmento de ADN está identificado en función de su muestra de partida y con los adaptadores para los cebadores de secuenciación.

Pool

En este punto es donde se pueden juntar las librerías de distintas muestras ya que cada una llevará su propio índice. La acción de juntar las muestras se llama “pool”. Es importante conocer la concentración que se ha obtenido de cada una de las librerías para así mezclar las muestras en igual proporción. Sucede con el fin de que todas las muestras estén igual de representadas en los resultados de la secuenciación.

Sequencing by sythesis

Para la secuenciación, la tecnología predominante es la que se llama secuenciación por síntesis (sequencing by synthesis). La gran mayoría de los equipos que se usan para ello son los de la multinacional Illumina. Dentro de esta compañía existen diferentes modelos de secuenciador. Los más conocidos son Miseq, el NextSeq y HiSeq. La principal diferencia entre ellos es la cantidad de datos que producen, en función del tamaño de la región o regiones de interés o del número de muestras se escogerá un equipo u otro.

El funcionamiento de todos ellos es el mismo: a través de un sistema de fluídico, el equipo distribuye las librerías que se ha visto preparado sobre un soporte llamado Flowcell. En la superficie hay unos oligonucleótidos con una secuencia complementaria a los adaptadores que tiene la librería. De este modo se unirán las moléculas por complementariedad. Una vez unida cada molécula, va a generar copias idénticas a su alrededor mediante una amplificación con la misma base que la PCR llamada bridge PCR. Así se genera un clúster de moléculas idénticas.

Flowcell

Una vez generado el clúster, se añade un primer complementario al adaptador que no está unido a la flowcell: el que queda libre, que servirá para empezar la secuenciación. Hay que recordar que para que la polimerasa empiece a copiar, es necesario partir de un fragmento que esté en doble cadena.

Se va a inundar la flowcell con unos nucleótidos fluorescentes modificados (ddNTPs) para que se una solo uno. Es decir, que al unirse no permitan que se unan más a continuación gracias a la presencia de terminadores. Al unirse emite fluorescencia de un color u otro según el nucleótido (ATCG). Además, las cámaras del equipo toman una foto del instante.

Aplicaciones

Muchas aplicaciones se han visto beneficiadas con los avances de los secuenciadores high-throughput, tanto en rapidez como en ahorro de costes. No obstante, también han surgido nuevas aplicaciones impensables antes de la llegada de la secuenciación masiva:

  • Secuenciación de genomas, tanto procariotas como eucariotas, de novo o conocidos.
  • La genómica es el área de la genética que se refiere al estudio y análisis de la información genética. Aquí, las aplicaciones van desde la función estructural de los genomas hasta la célula única.
  • Metagenómica, la secuenciación de la diversidad microbiana.
  • La secuenciación del ADN antiguo permite conocer genomas de especies ya extinguidas.
  • Estudios de metilación para entender los silenciamientos genéticos, la compactación de la cromatina, la estabilidad del genoma o incluso la inactivación del cromosoma X.

Single molecule

Si a las técnicas de NGS se las ha llamado de segunda generación, la tercera generación de secuenciadores de ADN son los secuenciadores de una sola molécula. Se les llama así porque utilizan una sola molécula como molde para la secuenciación, sin necesidad de amplificación ni preparación de librerías.

Otra gran diferencia respecto a los secuenciadores de su generación anterior es que estos no disponen de sistema óptico para la detección de los fluorocromos. Lo anterior permite que los equipos sean mucho más pequeños, más económicos y con menos mantenimiento. Los secuenciadores de tercera generación son mucho más pequeños que sus predecesores. En algunos casos, son incluso portátiles.

Tras una pequeña preparación de las muestras, se carga el producto en el secuenciador. Está dotado de una membrana llena de nanoporos biológicos, unos agujeros de proteínas. Estas proteínas capturan las moléculas enteras de ADN. También una corriente iónica a través de los nanoporos es capaz de identificar la molécula que pasa por el poro en cada momento.

ADN y nutrición

La nutrigenómica ha creado nuevas vías de trabajo e intervención que suponen un horizonte infinito de posibilidades. A pesar de que TECH Universidad Tecnológica ya contaba con programas de especialización nutricional como el Máster en Nutrición Clínica y el Máster en Seguridad Alimentaria para Nutricionistas, la aparición del Máster en Nutrición Genómica y de Precisión significa un salto en primeria línea en la actualización tecnológica de las disciplinas en nutrición.

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