Secuenciación

La secuenciación permite comprender la conformación adecuada de la estructura ADN en el ser humano.

facultad de farmacia
viernes, 29 de julio de 2022
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El genoma humano contiene entre 20000 y 25000 genes. Cada uno de estos genes lleva la información necesaria para la síntesis de una proteína. Estas bases se empaquetan en los 23 pares de cromosomas y se almacenan en el núcleo de cada una de las células del cuerpo. La secuenciación del genoma humano está formado por 3200 millones de pares de bases de ADN. Estos pares de bases se llaman nucleótidos y son la unidad estructural básica que se une para dar lugar a los ácidos nucleidos:

  • ADN – Ácido Desoxirribonucleico
  • ARN – Ácido Ribonucleico

Los nucleótidos están formados por una molécula de azúcar (ribosa en el ARN y desoxirribosa en el ADN) unida a un grupo fosfato y a una base nitrogenada. Las bases nitrogenadas son cuatro: Adenina (A), Citosina (C), Timina (T) y Guanina (G); en el ARN se sustituye la Timina (T) por el Uracilo (U). Cualquier técnica que permita poner en orden dos o más bases del genoma será una técnica de secuenciación de ADN, mientras que cualquier lectura de dos o más nucleótidos será una secuencia de ADN.

Historia del método

La secuenciación es el proceso mediante el cual se determina el orden preciso de los nucleótidos en una molécula de ADN. Conocer las secuencias de ADN se ha hecho indispensable en la investigación biológica, teniendo muchas aplicaciones como el diagnóstico de patologías genéticas, la genética forense, la identificación de especies, metagenómica, virología, biología de sistemas, entre otras. Los métodos de secuenciación masiva han tenido una repercusión muy importante en los recientes descubrimientos de la medicina y la investigación biomolecular, pero no siempre ha sido así.

Métodos antiguos

El primer método de secuenciación fue desarrollado por Maxam & Gilbert, y fue llamado secuenciación por degradación química. En el año 1977, Maxam & Gilbert desarrollaron un método en el que marcaban el extremo 5’ de la región de interés con radioactividad. Después ponían el producto de PCR marcada en cuatro tubos independientes y añadían en cada punto una enzima de restricción específica para cada uno de los cuatro nucleótidos. Una enzima de restricción puede reconocer una secuencia concreta de nucleótidos o incluso un solo nucleótido y cortar el ADN es ese punto concreto.

De este modo, en cada uno de los tubos podían cortar la cadena cuando esta presentaba un nucleótido conocido, obteniendo fragmentos de distinta longitud en cada uno de los tubos donde había tenido lugar la reacción. Seguidamente, cargaban el ADN fragmentado en un gel de agarosa y se hacía una electroforesis. Una electroforesis es una técnica que permite separar moléculas en función de su tamaño.

A menor tamaño del fragmento, este se desplaza a mayor velocidad. Para la interpretación de los resultados había que leer los fragmentos del más pequeño al más grande y mirar de que tubo procedía cada fragmento. Este método dio como resultado las primeras secuencias de ADN, pero era un proceso muy largo y las secuencias obtenidas muy cortas. Además, al no poder amplificar el ADN inicial, la cantidad de ADN necesaria era muy elevada y los resultados muy poco sensibles.

En el mismo año, Frederick Sanger desarrolló los didesoxinucleótidos (ddNTP). Los ddNTPs son nucleótidos a los que se les ha eliminado el grupo hidroxil (-OH) en el extremo 3’. Esta modificación impide que los nucleótidos se unan, formando las cadenas de ADN.

Protocolos básicos usados

La secuenciación de ADN por el método Sanger proporciona lecturas de unos 1000 pares de bases en poco más de dos horas. Las muestras se procesan individualmente en los capilares, lo que evita cualquier tipo de contaminación de cruzada procedente de las muestras contiguas y, finalmente, dos láseres facilitan unas lecturas homogéneas y fiables de los fluorocromos. Para llegar a la secuenciación y a la lectura del ADN, el método Sanger consta de seis pasos bien definidos.

  1. PCR: amplificación de la región de interés
  2. Purificación de la PCR para eliminar el exceso de cebadores y nucleótidos no incorporados.
  3. PCR de secuenciación
  4. Purificación de la PCR de secuenciación para eliminar el exceso de cebador y nucleótidos no incorporados.
  5. Precipitación del ADN para su posterior disolución en el tampón de secuenciación.
  6. Secuenciación.

Cabe mencionar la PCR de secuenciación, ya que esta difiere ligeramente de las PCRs que se han visto hasta ahora. A diferencia de una PCR de amplificación en que en cada ciclo se genera el doble de producto, en esta siempre se trabaja con la cadena molde que puesta inicialmente, y se centra en la generación de los fragmentos que serán los que se analizarán luego. En la reacción de la PCR de secuenciación solo se va a poner un cebador.

Así las cadenas siempre serán en la misma dirección y todas van a ser iguales. Junto con los nucleótidos también se pone didesoxinucleotidos en un porcentaje del 2 %. Esto hace que cuando la polimerasa va construyendo la nueva cadena de ADN complementaria al molde, cuando utiliza un ddNTP, la copia se para y no permite seguir elongando la cadena.

The Human Genome Project

En febrero de 2001 se presentó al mundo el primer genoma humano completo. Esta noticia fue portada de las principales revistas científicas del mundo, y representó la culminación de un largo trabajo. (Figura 11 y 12) Para la consecución del proyecto se utilizaron centenares de secuenciadores capilares de ADN, concretamente el modelo ABI 3730xl de Applied Biosystems. La técnica que se empleó fue exactamente la descrita anteriormente, pero al ser un genoma nuevo no se conocían las regiones donde pegar los cebadores y empezara a amplificar. Este se solucionó con lo que se llamó como “clone contig strategy”.

Clone Contig

El primer paso fue separar los distintos pares de cromosomas para así partir de 23 genomas iniciales más pequeños.

  • Una vez separados los cromosomas se fragmenta en ADN y se seleccionan fragmentos de unas 2 kb.
  • Se unen los fragmentos de 2 kb a un vector conocido.
  • Amplifica el vector pegando los cebadores a la región conocida
  • Secuenciación con un cebador
  • Mapeo con las regiones solapantes

Así, en febrero de 2001 se publicó la secuencia de ADN del primer genoma humano. Se secuenciaron 2693 millones de nucleótidos que cubrían un 84 % del genoma. El coste del proyecto fue de unos 3 billones de dólares, y duró unos 13 años. Hoy en día es posible secuenciar un genoma humano en menos de un día, y con un coste de 900 dólares.

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